Técnicas Laboratoriais do Laboratório Clínico Veterinário

Técnicas Laboratoriais do Laboratório Clínico Veterinário  

1. Determinação do número de hemácias /microlitro de sangue  A) Técnica do tubo de ensaio Colocar 4 ml do diluente em tubo de ensaio Homogeneizar a amostra Com uma pipeta automática, aspirar 20 ml de sangue Limpar o sangue na parte externa da pipeta Adicionar o sangue ao diluente (diluição de 1:200) Homogeneizar a solução Preencher a câmara de Neubauer Lavar ao microscopio optico, em aumento de 400x Contar 5/25 quadrados do quadradro central da camara O total encontrado nos cinco quadrados deve ser multiplicado por 10.000 (Segundo Jain, 1993) B) Técnica da pipeta de Thoma para glóbulos vermelhos Homogeneizar a amostra Aspirar o sangue até a marca 0,5 da pipeta de Thoma Limpar o sangue na parte externa da pipeta Completar com o diluente de Gower até a marca 101, obtendo-se uma diluição de 1:200 Homogeneizar a solução Desprezar as três primeiras gotas Preencher a câmara de Neubauer e deixa-la em repouso por alguns minutos Levar ao microscópio óptico, em aumento de 400x Contar 5/25 quadrados do quadrado central da câmara O total encontrado nos cinco quadrados deve ser multiplicado por 10.000 (Segundo Jain, 1993) 2. Determinação do Volume Globular ou Hematócrito  Homogeneizar a amostra Preencher um tubo capilar em aproximadamente 2/3 do seu comprimento com sangue Limpar a parte externa do tubo capilar Fechar a extremidade do lado oposto ao da entrada do sangue com a massa acrílica Colocar na microcentrífuga a parte com a massa virada para a borracha Centrifugar a 10.000 rpm por 5 minutos para carnívoros, eqüinos e durante 10 minutos para ruminantes, exceto caprinos que são necessários 15 minutos Realizar a leitura do cartão, sendo o resultado expresso em percentagem (%) (Segundo Schalm, 1974) 3. Determinação da Hemoglobina (Técnica com o reagente de Cianometahemoglobina) Homogeneizar a amostra Identificar tres tubosde ensaio com P (padrão), T (teste) e B (branco) Adicionar 5 ml de diluente em cada tubo Adicionar 20 ml de sangue notubo T e homogeneizar bem Adicionar 20 ml do padrão (kit comercial no tubo P e homogeneizar bem Deixar em repouso por 5 minutos Limpar o tubo que será utilizado no fotocolorímetro com uma gaze Zerar o aparelho com o branco Efetuar a leitura em filtro de 540 mm, em absorbância O valor do padrão é obtido dividindo-se por 10, pela sua leitura O valor do teste é obtido multiplicando-se o valor do padrão pela leitura do teste O resultado é dado em gramas por decilitro (g/dl) (Segundo Coles, 1984) 4. Determinação do número total de leucócitos/ ml de sangue A) Técnica do tubo de ensaio Colocar 0,4 ml do diluente em tubo de ensaio Homogeneizar a amostra Com uma pipeta automática, aspirar 20 ml de sangue Limpar o sangue na parte externa da pipeta Adicionar o sangue ao diluente (diluição de 1:20) Homogeneizar a solução Preencher a câmara de Neubauer Lavar ao microscópio óptico, em aumento de 100x Contar os quatro quadrados grandes da câmara O total encontrado nos quatro quadrados deve ser multiplicado por 52,5 Expressar o resultado como total de leucócitos/ml ou mm3 B) Técnica da pipeta de Thoma para Glóbulos Brancos Homogeneizar a amostra Aspirar o sangue até a marca 0,5 da pipeta de Thoma Limpar o sangue na parte externa da pipeta Completar com o diluente de Turk até a marca 11, obtendo-se uma diluição de 1:20 Homogeneizar a solução Desprezar as três primeiras gotas Preencher a câmara de Neubauer e deixa-la em repouso por alguns minutos Levar ao microscópio óptico, em aumento de 100x Contar os quatro quadrados grandes da câmara O total encontrado nos quatro quadrados grandes deve ser multiplicado por 50 (segundo Jain, 1993) 5. Contagem diferencial de leucócitos (Técnica para confecção do esfregaço sangüíneo) Limpar bem a lamina para desengordurar Homogeneizar a amostra Colocar uma gota de sangue próxima a uma das extremidades da lamina e com outra lamina ou lamínula (como extensora), encostar na frente da gota e quando esta espalhar, arrastá-la para frente com um movimento rápido e homogêneo angulo entre a lamínula e a extensora deve ser de aproximadamente 45° Secar a lamina ao ar, imediatamente após a sua confecção Identificar a lamina com o nome do animal ou o numero da ficha Corar a lamina, iniciando do mais claro (álcool) para o mais escuro, deixando aproximadamente 10 segundos nos tres corantes do panótico Retirar sempre o excesso entre um corante e outro e lavar em água corrente após o ultimo corante Depois de seco, observar o esfregaço em microscópio óptico, a principio, em aumento de 400x para avaliação inicial da distribuição celular sucedido do reconhecimento, contagem e avaliação citomorfológica, feitos em aumento de 1000x (objetiva de imersão) (segundo Matos & Matos, 1995) 6. Contagem de plaquetas A) Contagem direta Homogeneizar a amostra Aspirar o sangue até a marca 0,5 da pipeta de Thoma Limpar o sangue na parte externa da pipeta Completar com o diluente de Gower até a marca 101, obtendo-se uma diluição de 1:200 Homogeneizar a solução Desprezar as três primeiras gotas Preencher a câmara de Neubauer e deixa-la em repouso por 20 minutos em câmara úmida (placa de Petri com algodão embebido em água) Levar ao microscópio óptico, em aumento de 400x Contar 25 quadrados centrais do dois lados da câmara O total encontrado nos 25 quadrados deve ser multiplicado por 1.000 (Segundo Jain, 1993) B) Contagem Indireta  Homogeneizar a amostra Fazer o esfregaço sangüíneo Observar em objetiva de imersão (aumento de 1000x) Contar o número de plaquetas em 5 campos, com aproximadamente 100 hemácias cada Multiplicar o total de plaquetas pelo número de hemácias (Segundo Coles, 1984) 7. Urinálise Observar a coloração, odor, aspecto e volume Colocar 10 ml da amostra no tubo cônico e mergulhar a fita reativa na amostra Retirar o excesso da urina da fita (inclinado-a lateralmente em um papel tendo-se o cuidado para que um resultado não seja interferido pôr outro) Anotar os resultados pertinentes (glicose, proteína, billirrubina, urobilinogenio, cetona, sangue, Ph e nitrito) Colocar o tubo com amostra para centrifugar pôr 5 minutos a 1.500 rpm, para realização da sedimentoscopia · sobrenadante é desprezado deixando-se 0,5 ml do sedimento e este é colocado entre lamina e lamínula Observa-se em microscopio optico em aumento de 400x se apresenta leucocitos, eritrocitos, celulas epiuteliais, cilindros, bactérias, leveduras e fungos, cristais, espermatozoides. É importante mover o condensador para baixo Para verificação da densidade, coloca-se uma gota da amostra no refratômetro, observando-se a escala do lado direito (Segundo Matos & Matos, 1995) 8. Determinação da proteína plasmática total (PPT) e do fibrinogênio  Homogeneizar a amostra Preencher um tubo capilar em aproximadamente 2/3 do seu comprimento com sangue Limpar a parte externa do tubo capilar Fechar a extremidade do lado oposto ao da entrada do sangue com a massa acrílica Colocar na microcentrífuga a parte com a massa virada para a borracha Centrifugar a 10.000 rpm por 5 minutos para carnívoros, eqüinos e durante 10 minutos para ruminantes, exceto caprinos que são necessários 15 minutos Calibrar o refratômetro com agua destilada (o inicio da faixa azul deve estar no W), secar a plataforma Apos a centrifugação, com o tubo é realizada a dosagem do VG e da PPT, onde o tubo é quebrado acima da coluna de leucocitos e o plasma é colocado no refratômetro, previamente calibrado, fazendo-se então a leitura (ponto onde a linha azul se inicia na escala e é expresso em g/dl) O segundo tubo é levado ao banho maria a 56 ºC pôr tres minutos, para a coagulação do fibrinogênio, sendo centrifugado novamente pôr mais três minutos para que ocorra a precipitação do fibrinogênio A diferença entre a primeira leitura (PPT) e a Segunda (proteina sem fibrinogênio) é multiplicado pôr 1000 é o valor do fibrinogênio dado em mg/dl