quarta-feira, 1 de abril de 2015

Técnicas Laboratoriais do Laboratório Clínico Veterinário

Técnicas Laboratoriais do Laboratório Clínico Veterinário  

1. Determinação do número de hemácias /microlitro de sangue 

A) Técnica do tubo de ensaio
  • Colocar 4 ml do diluente em tubo de ensaio
  • Homogeneizar a amostra
  • Com uma pipeta automática, aspirar 20 ml de sangue
  • Limpar o sangue na parte externa da pipeta
  • Adicionar o sangue ao diluente (diluição de 1:200)
  • Homogeneizar a solução
  • Preencher a câmara de Neubauer
  • Lavar ao microscopio optico, em aumento de 400x
  • Contar 5/25 quadrados do quadradro central da camara
  • O total encontrado nos cinco quadrados deve ser multiplicado por 10.000 (Segundo Jain, 1993)
    B) Técnica da pipeta de Thoma para glóbulos vermelhos
  • Homogeneizar a amostra
  • Aspirar o sangue até a marca 0,5 da pipeta de Thoma
  • Limpar o sangue na parte externa da pipeta
  • Completar com o diluente de Gower até a marca 101, obtendo-se uma diluição de 1:200
  • Homogeneizar a solução
  • Desprezar as três primeiras gotas
  • Preencher a câmara de Neubauer e deixa-la em repouso por alguns minutos
  • Levar ao microscópio óptico, em aumento de 400x
  • Contar 5/25 quadrados do quadrado central da câmara
  • O total encontrado nos cinco quadrados deve ser multiplicado por 10.000 (Segundo Jain, 1993)

  • 2. Determinação do Volume Globular ou Hematócrito 
  • Homogeneizar a amostra
  • Preencher um tubo capilar em aproximadamente 2/3 do seu comprimento com sangue
  • Limpar a parte externa do tubo capilar
  • Fechar a extremidade do lado oposto ao da entrada do sangue com a massa acrílica
  • Colocar na microcentrífuga a parte com a massa virada para a borracha
  • Centrifugar a 10.000 rpm por 5 minutos para carnívoros, eqüinos e durante 10 minutos para ruminantes, exceto caprinos que são necessários 15 minutos
  • Realizar a leitura do cartão, sendo o resultado expresso em percentagem (%) (Segundo Schalm, 1974)
    3. Determinação da Hemoglobina
    (Técnica com o reagente de Cianometahemoglobina)
  • Homogeneizar a amostra
  • Identificar tres tubosde ensaio com P (padrão), T (teste) e B (branco)
  • Adicionar 5 ml de diluente em cada tubo
  • Adicionar 20 ml de sangue notubo T e homogeneizar bem Adicionar 20 ml do padrão (kit comercial no tubo P e homogeneizar bem
  • Deixar em repouso por 5 minutos
  • Limpar o tubo que será utilizado no fotocolorímetro com uma gaze
  • Zerar o aparelho com o branco
  • Efetuar a leitura em filtro de 540 mm, em absorbância
  • O valor do padrão é obtido dividindo-se por 10, pela sua leitura
  • O valor do teste é obtido multiplicando-se o valor do padrão pela leitura do teste
  • O resultado é dado em gramas por decilitro (g/dl) (Segundo Coles, 1984)
    4. Determinação do número total de leucócitos/ ml de sangue

    A) Técnica do tubo de ensaio
  • Colocar 0,4 ml do diluente em tubo de ensaio
  • Homogeneizar a amostra
  • Com uma pipeta automática, aspirar 20 ml de sangue
  • Limpar o sangue na parte externa da pipeta
  • Adicionar o sangue ao diluente (diluição de 1:20)
  • Homogeneizar a solução
  • Preencher a câmara de Neubauer
  • Lavar ao microscópio óptico, em aumento de 100x
  • Contar os quatro quadrados grandes da câmara
  • O total encontrado nos quatro quadrados deve ser multiplicado por 52,5
  • Expressar o resultado como total de leucócitos/ml ou mm3

    B) Técnica da pipeta de Thoma para Glóbulos Brancos
  • Homogeneizar a amostra
  • Aspirar o sangue até a marca 0,5 da pipeta de Thoma
  • Limpar o sangue na parte externa da pipeta
  • Completar com o diluente de Turk até a marca 11, obtendo-se uma diluição de 1:20
  • Homogeneizar a solução
  • Desprezar as três primeiras gotas
  • Preencher a câmara de Neubauer e deixa-la em repouso por alguns minutos
  • Levar ao microscópio óptico, em aumento de 100x
  • Contar os quatro quadrados grandes da câmara
  • O total encontrado nos quatro quadrados grandes deve ser multiplicado por 50 (segundo Jain, 1993)
    5. Contagem diferencial de leucócitos
    (Técnica para confecção do esfregaço sangüíneo)
  • Limpar bem a lamina para desengordurar
  • Homogeneizar a amostra
  • Colocar uma gota de sangue próxima a uma das extremidades da lamina e com outra lamina ou lamínula (como extensora), encostar na frente da gota e quando esta espalhar, arrastá-la para frente com um movimento rápido e homogêneo
  • angulo entre a lamínula e a extensora deve ser de aproximadamente 45°
  • Secar a lamina ao ar, imediatamente após a sua confecção
  • Identificar a lamina com o nome do animal ou o numero da ficha
  • Corar a lamina, iniciando do mais claro (álcool) para o mais escuro, deixando aproximadamente 10 segundos nos tres corantes do panótico
  • Retirar sempre o excesso entre um corante e outro e lavar em água corrente após o ultimo corante
  • Depois de seco, observar o esfregaço em microscópio óptico, a principio, em aumento de 400x para avaliação inicial da distribuição celular sucedido do reconhecimento, contagem e avaliação citomorfológica, feitos em aumento de 1000x (objetiva de imersão) (segundo Matos & Matos, 1995)
    6. Contagem de plaquetas

    A) Contagem direta
  • Homogeneizar a amostra
  • Aspirar o sangue até a marca 0,5 da pipeta de Thoma
  • Limpar o sangue na parte externa da pipeta
  • Completar com o diluente de Gower até a marca 101, obtendo-se uma diluição de 1:200
  • Homogeneizar a solução
  • Desprezar as três primeiras gotas
  • Preencher a câmara de Neubauer e deixa-la em repouso por 20 minutos em câmara úmida (placa de Petri com algodão embebido em água)
  • Levar ao microscópio óptico, em aumento de 400x
  • Contar 25 quadrados centrais do dois lados da câmara
  • O total encontrado nos 25 quadrados deve ser multiplicado por 1.000 (Segundo Jain, 1993)

    B) Contagem Indireta 
  • Homogeneizar a amostra
  • Fazer o esfregaço sangüíneo
  • Observar em objetiva de imersão (aumento de 1000x)
  • Contar o número de plaquetas em 5 campos, com aproximadamente 100 hemácias cada
  • Multiplicar o total de plaquetas pelo número de hemácias (Segundo Coles, 1984)
    7. Urinálise
  • Observar a coloração, odor, aspecto e volume
  • Colocar 10 ml da amostra no tubo cônico e mergulhar a fita reativa na amostra
  • Retirar o excesso da urina da fita (inclinado-a lateralmente em um papel tendo-se o cuidado para que um resultado não seja interferido pôr outro)
  • Anotar os resultados pertinentes (glicose, proteína, billirrubina, urobilinogenio, cetona, sangue, Ph e nitrito)
  • Colocar o tubo com amostra para centrifugar pôr 5 minutos a 1.500 rpm, para realização da sedimentoscopia · sobrenadante é desprezado deixando-se 0,5 ml do sedimento e este é colocado entre lamina e lamínula
  • Observa-se em microscopio optico em aumento de 400x se apresenta leucocitos, eritrocitos, celulas epiuteliais, cilindros, bactérias, leveduras e fungos, cristais, espermatozoides. É importante mover o condensador para baixo
  • Para verificação da densidade, coloca-se uma gota da amostra no refratômetro, observando-se a escala do lado direito (Segundo Matos & Matos, 1995)
    8. Determinação da proteína plasmática total (PPT) e do fibrinogênio 
  • Homogeneizar a amostra
  • Preencher um tubo capilar em aproximadamente 2/3 do seu comprimento com sangue
  • Limpar a parte externa do tubo capilar
  • Fechar a extremidade do lado oposto ao da entrada do sangue com a massa acrílica
  • Colocar na microcentrífuga a parte com a massa virada para a borracha
  • Centrifugar a 10.000 rpm por 5 minutos para carnívoros, eqüinos e durante 10 minutos para ruminantes, exceto caprinos que são necessários 15 minutos
  • Calibrar o refratômetro com agua destilada (o inicio da faixa azul deve estar no W), secar a plataforma
  • Apos a centrifugação, com o tubo é realizada a dosagem do VG e da PPT, onde o tubo é quebrado acima da coluna de leucocitos e o plasma é colocado no refratômetro, previamente calibrado, fazendo-se então a leitura (ponto onde a linha azul se inicia na escala e é expresso em g/dl)
  • O segundo tubo é levado ao banho maria a 56 ºC pôr tres minutos, para a coagulação do fibrinogênio, sendo centrifugado novamente pôr mais três minutos para que ocorra a precipitação do fibrinogênio
  • A diferença entre a primeira leitura (PPT) e a Segunda (proteina sem fibrinogênio) é multiplicado pôr 1000 é o valor do fibrinogênio dado em mg/dl